1.线粒体膜电位检测实验背景介绍：

线粒体作为细胞能量代谢与凋亡调控的关键双层膜细胞器，线粒体内膜两侧形成的线粒体膜电位（ΔΨm）是维持 ATP 合成、离子稳态及线粒体正常生理功能的基础，膜电位去极化是细胞凋亡早期标志性事件，氧化应激、药物、缺氧等刺激均会破坏膜电位稳态；基于亲脂阳离子荧光探针可依靠电势差特异性富集于线粒体的原理，利用 JC-1、TMRM 等荧光染料进行染色，通过荧光强度或荧光颜色变化定量、定性检测膜电位水平，以此评价线粒体功能损伤程度、判断细胞凋亡发生进程，是细胞药理、毒理、肿瘤及氧化应激研究中经典的细胞功能检测手段。

2.线粒体膜电位检测实验的意义：

检测线粒体膜电位可直观反映线粒体氧化磷酸化功能完整性，膜电位下降作为细胞凋亡早期特征指标，借助荧光染色定量分析膜电位变化，能够评估药物、氧化应激、缺氧等处理对细胞线粒体的损伤程度，阐明受试干预因素的细胞毒性、抗凋亡或促凋亡作用机制，为药理学、肿瘤生物学、细胞损伤及抗衰老相关研究提供关键细胞学依据。

3.线粒体膜电位检测实验过程：

实验时间：2026年07月25日 15：10-17：13；

实验设备及厂家：CELLImage Mini全自动活细胞成像仪、离心机、恒温水浴锅；

实验耗材及厂家：24孔板；

实验试剂：培养基、小牛血清、青链霉素溶液、胰蛋白酶、线粒体膜电位检测试剂盒；

细胞类型：A549、H9C2。

3.1线粒体膜电位检测实验步骤：

（1）实验准备：将配好的完全培养基和胰蛋白酶从2-8℃ 中取出放置到水浴箱预热30 min 左右。并对生物安全柜紫外照射消杀30min；

（2）观察细胞：将细胞放置于CELLImage Mini全自动活细胞成像仪观察细胞的状态及密度，细胞融合度达到 80%-90%即可进行传代；

（3）细胞传代：将生长对数期的细胞消化收集于15ml离心管，离心去上清，重悬细胞进行计数，按照1:20的比例进行铺板，在24孔板中将每种细胞种3个孔，于37°C、5%CO2 饱和湿度培养箱内培养24h；

（4）线粒体膜电位染色工作液的配制：六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50-100万细胞需0.5ml JC-1染色工作液。取适量JC-1(200X)，按照每50µl JC-1(200X)加入8ml超纯水的比例稀释JC-1。剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1染色缓冲液(5X)，混匀后即为JC-1染色工作液；

（5）加入JC-1染色工作液：用适量PBS洗涤细胞一次，加入250ul细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红；随后加入250ul JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟；

（6）配制JC-1染色缓冲液(1X)：在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴；

（7）洗涤细胞：37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。

（8）Hoechest33342染色：加入稀释后的hoechest33342（1X），染色15min。

（9）洗涤细胞：用适量PBS缓冲液清洗细胞2次，随后加入500ul细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红；

（10）活细胞成像观察：将染色好的24孔板放置于CELLImage Mini全自动活细胞成像仪适配器上，选择适合的点位对细胞进行明场、红色荧光和蓝色荧光调整参数并进行图像采集。

3.2 实验结果图像展示:

A549线粒体膜电位染色图像（明场+红荧光+蓝荧光）

A549线粒体膜电位染色图像（红荧光+蓝荧光）

H9C2线粒体膜电位染色图像（明场+红荧光+蓝荧光）

H9C2线粒体膜电位染色图像（红荧光+蓝荧光）