一、5-FU诱导细胞凋亡实验的原理及目的

5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是临床应用超半个世纪的经典抗代谢类化疗药物，凭借广谱、高效的抗肿瘤活性，被广泛用于宫颈癌、结直肠癌、头颈部鳞癌等多种实体肿瘤的临床治疗。5-FU主要通过模拟尿嘧啶参与细胞核酸代谢过程，掺入肿瘤细胞DNA与RNA合成体系，干扰肿瘤细胞核酸复制、转录与修复过程，阻滞细胞周期进程，最终诱导肿瘤细胞凋亡，实现抗肿瘤治疗效果。

Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(PS)。PS主要分布在细胞膜内侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。正常细胞不会被Annexin V-mCherry所染色，凋亡细胞和坏死细胞都会被nexin V-mCherry所染色，发出红色荧光。

二、活细胞成像应用于检测细胞凋亡实验中的的意义

当前实验室检测细胞凋亡的常规方法，包括MTT比色法、流式细胞术、TUNEL染色、Western Blot蛋白检测等，均为终点式检测手段，需固定、裂解或染色处理细胞，不仅会破坏细胞活性，无法实时追踪药物作用下细胞形态、数量及凋亡进程的动态时序变化，还难以捕捉凋亡早期瞬时生物学事件，易遗漏药物作用的关键时间节点与动态效应差异，无法完整还原5-FU诱导HeLa细胞凋亡的全过程，存在检测时效性、连续性不足的局限性，难以满足药物动态作用机制深度研究的需求。

活细胞成像技术的发展为动态监测药物干预下细胞生命活动提供了全新技术支撑，突破了传统终点检测方法的技术瓶颈。本研究采用活细胞成像系统联合联合活细胞Annexin V细胞凋亡检测试剂盒开展实验检测。该活细胞检测试剂盒可在维持HeLa细胞正常生理活性的前提下，实现凋亡早期PS外翻动态标记，适配活细胞长时间连续成像检测需求。

三、将活细胞成像应用于细胞凋亡实验的案例

以下是我们5-FU诱导HeLa细胞凋亡实验过程和实验图像采集及图像效果、分析结果。

实验时间：2026年05月29日

实验设备：CELLImage Mini全自动活细胞成像仪（联庆瑞奇）

实验材料：对数生长期hela细胞（逸漠生物），活细胞Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（国产），5-FU（10mM，溶解于DMSO）（国产），无菌细胞培养耗材（48孔板、离心管、移液枪头、培养瓶）

1.实验过程：

1.1实验准备：将配好的完全培养基和胰蛋白酶从2-8℃ 中取出放置到水浴箱预热30 min 左右。并对生物安全柜紫外照射消杀30min；

1.2观察细胞：将细胞放置于CELLImage Mini全自动活细胞成像仪观察细胞的状态及密度，细胞融合度达到 80%-90%即可进行传代；

1.3细胞传代：将生长对数期的细胞消化收集于15ml离心管，离心去上清，重悬细胞进行计数，在48孔板中间种入适量的细胞，于37°C、5%CO2 饱和湿度培养箱内培养24h；

1.4药物处理：次日，将48孔板中的培养基弃掉，加入适量PBS清洗一次，将5-FU分别按照20uM、40uM、60uM使用浓度提前用完全培养基配制好，按照每孔400ul分别加入对应的孔中；

1.5探针标记：将活细胞Annexin V细胞凋亡检测试剂盒按照说明书推荐稀释到终浓度后加入48孔板中，持续培养，并观察荧光变化；1.5探针标记：将活细胞Annexin V细胞凋亡检测试剂盒按照说明书推荐稀释到终浓度后加入48孔板中，持续培养，并观察荧光变化。

2.密切监测hela细胞状态：

将不同浓度5-FU处理和探针标记的48孔板hela细胞放置于37℃，5%CO2，90%左右湿度条件的培养箱中CELLImage Mini全自动活细胞成像仪的适配器上，通过Readcells软件设置间隔6h拍摄一次荧光及明场图像，采集图像总周期数20次，监测总时间为120h。

3.实验图像展示：

不同浓度的5-FU处理后不同时间明场红荧光叠加图像

四.实验结果分析

不同浓度的5-FU处理后不同时间的荧光总强度变化曲线图

根据不同时间红色荧光总强度统计图显示，5-FU处理12-24小时后逐渐出现细胞凋亡事件，随着药物浓度提升以及处理时间延长，细胞皱缩和凋亡事件加剧，凋亡细胞（红色荧光）数量增加，且不同浓度之间存在倍比关系。

五、实验视频

不同浓度5-FU 处理的红色荧光视频