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活细胞成像仪在3D培养模型中重现肿瘤微环境的应用研究
一、实验原理及目的
传统二维（2D）平面细胞培养体系中，肿瘤细胞仅能实现单层贴壁生长，缺失体内肿瘤组织特有的立体细胞间连接、胞外基质支撑结构，同时无法构建氧气、营养物质、代谢废物的浓度梯度微环境。该培养模式下，肿瘤细胞的形态结构、增殖凋亡特性、侵袭迁移能力及信号通路表达、药物应答规律均与体内原生肿瘤组织存在显著差异，难以真实模拟肿瘤发生、发展及耐药的生理病理过程，极大地限制了肿瘤机制研究、抗肿瘤药物筛选的准确性与可靠性。
三维（3D）肿瘤球培养技术依托Matrigel基质胶构建仿生胞外基质支架，可诱导肿瘤细胞自主聚集、有序增殖，自组装形成结构完整的三维球状类肿瘤组织。该模型能够精准复刻体内肿瘤核心微环境特征，包括细胞紧密立体连接、肿瘤缺氧区域、营养与代谢梯度、细胞-基质相互作用等，是目前体外模拟真实肿瘤微环境、开展肿瘤生物学研究的核心模型。Matrigel基质胶富含层粘连蛋白、IV型胶原、蛋白多糖及多种活性生长因子，低温液态状态下可均匀铺板，经37℃恒温孵育后可自发聚合形成多孔网状三维支架，为肿瘤细胞立体生长、黏附、侵袭提供稳定的物理支撑与生物微环境。
二、活细胞成像技术应用于3D肿瘤微环境模型的研究意义
常规检测方式不仅操作繁琐、实验样本损耗大，更无法捕捉肿瘤球从细胞聚集、球体成型、成熟生长到侵袭转移的动态演变过程，难以追踪同一肿瘤模型的连续生长规律，仅能反映某一时刻的静态特征，极易忽略肿瘤微环境动态变化、肿瘤细胞增殖侵袭的关键时序特征，导致实验数据片面性强、重复性差。
CELLImage系列全自动活细胞成像仪与3D肿瘤培养模型的结合，彻底弥补了传统终点检测技术的短板。试验样品可放置在活细胞成像仪成像区域，无需转移样本、无需中断培养过程，可实现原位、长时间、不间断显微成像观测。通过明场通道可实时记录3D肿瘤球的形态轮廓、球体大小、结构完整性及外周侵袭情况；结合荧光特异性染色通道，观察肿瘤球整体状态。
三、实验材料与设备
实验时间：
2026年08月07日-2026年08月12日；
实验设备：
CELLImage Mini Pro全自动活细胞成像仪（联庆瑞奇）、超净工作台、CO₂恒温培养箱、高速离心机、恒温水浴锅、精密移液枪、低温冰箱；
实验耗材：
细胞培养96孔板、无菌枪头、离心管等；
实验试剂：
Matrigel基质胶（逸漠生物）、DMEM完全培养基（逸漠生物）、胰蛋白酶等；
细胞类型：
Hela、A375细胞。
四、活细胞成像仪在3D培养模型中重现肿瘤微环境的应用研究
1.3D肿瘤微环境模型构建实验步骤
（1）实验准备：将配好的完全培养基和胰蛋白酶从2-8℃ 中取出放置到水浴箱预热30 min 左右。并对生物安全柜紫外照射消杀30min；
（2）基质胶支架铺制：取出预冷的无菌多孔培养板，每孔加入40 μL 50%浓度的Matrigel基质胶，轻轻水平晃动培养板，使基质胶均匀平铺于孔底，形成厚度均一的三维支撑胶层。将铺胶完成的培养板平稳置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中孵育30 min，使基质胶充分聚合凝固；
（3）细胞接种：取对数生长期状态良好的肿瘤细胞，弃去旧培养基，经胰酶消化、完全培养基终止消化后，收集细胞悬液置于离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清后用预热的完全培养基轻柔重悬细胞，充分吹打混匀后进行细胞计数，调整细胞悬液至适宜浓度。向凝固的基质胶上层每孔加入150 μL制备好的肿瘤细胞悬液，保证细胞均匀分布于基质胶表面；
（4）活细胞全程动态监测：将接种完成的培养板平稳放置于全自动活细胞成像仪适配器上，维持37℃、5%CO₂、90%以上湿度的稳定生理环境，通过Readcells软件设置Hela细胞Z轴叠加，焦距间距为20μM，上下各拍摄5层，设置A375细胞为固定焦距拍摄，检测周期为每4 h自动扫描成像一次，总周期数为30次，拍摄总时间120h，持续动态监测3D肿瘤微环境下肿瘤球的发育演变过程。
2.实验结果展示
Hela细胞肿瘤球不同时间z轴叠加图像
A375细胞肿瘤球不同时间固定焦距拍摄图像
3.实验结果分析
上图为3D细胞在微环境中构建中琉球的汇合度动态变化曲线。观测周期内，细胞汇合度整体随培养时间延长呈持续上升趋势，生长过程存在阶段性波动。培养前期细胞汇合度较低，随培养推进逐步升高；在培养后期汇合度达到峰值后出现小幅回落，随后维持在较高水平，反映三维肿瘤球在增殖成熟后，受球体内部营养、氧气供给限制，生长状态发生动态变化。
4.实验视频
Hela细胞肿瘤球z轴叠加及A375细胞肿瘤球动态视频
5.实验结论
实验主要用Hela和A375两种细胞以基质胶支架方式构建微环境进行肿瘤球培养；搭配CELLImage活细胞成像仪能够捕捉三维培养体系中细胞生长迟滞、增殖速率变化、肿瘤球成熟后内部微环境改变引发的生长波动等动态细节；而传统单时间点终点检测仅能获取静态结果，极易丢失三维肿瘤球生长过程中的关键动力学信息。可为后续基于 3D 肿瘤球模型的药物筛选、细胞侵袭及耐药机制研究提供时序性、连续性的生物学数据支撑。
