实验时间

    2025年05月29日14：50-15：50。

实验设备及厂家

    CELLImage Mini全自动活细胞成像仪（联庆瑞奇）、离心机（国产 ） 。

实验耗材及厂家

    24孔板（国产）、离心管（国产）等

实验试剂实验试剂

    线粒体绿色荧光探针（国产）、DAPI细胞核染料（逸漠生物）、完全培养基（逸漠生物）、PBS缓冲液（逸漠生物）等。

细胞类型

    A375细胞为例。

 

一、活细胞线粒体荧光探针标记实验步骤

1、Mito-Tracker Green储存液的配制

无水DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide)配制Mito-Tracker Green至终浓度为1mM。配制后可以-20℃或更低温度避光保存。

2、Mito-Tracker Green工作液的配制

  2.1、取少量1mMMito-TrackerGreen储存液按照1:5000-1:50,000的比例加入到细胞培养液中，使最终浓度为20-200nM。取1μlMito-Tracker Green加入到5ml或50ml细胞培养液中。混匀后即为Mito-Tracker Green工作液

  2.2、Mito-Tracker Green工作液使用前需37℃预温育。注:工作液中Mito-Tracker Green的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Mito-Tracker Green。

3. 线粒体的荧光标记

  3.1 去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并37C预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞37℃共孵育15-45分钟。

  3.2 去除Mito-Tracker Green染色工作液。

 

二、 细胞核染色

1、DAPI染色液的稀释

    DAPI工作液浓度通常为 1-10 µg/mL，将1mg/ml DAPI原液吸取10ul加入990ul ddH2O中，充分混匀。

2、染色步骤

  2.1、将 DAPI 工作液取100ul加入到完成线粒体荧光标记的细胞孔内，染色时间为 10-30 min，具体时间可根据细胞类型和实验需求进行调整。

  2.2、染色完成后用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次 5 分钟，以去除未结合的 DAPI染色液。

三、图像采集

    将完成线粒体荧光标记和细胞核染色的孔板放置于CELLImage Mini全自动活细胞成像仪观察并进行图像采集，此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色，细胞核呈明亮的蓝色。

 

四、实验图像展示

五、实验总结

    CELLImage全自动活细胞成像仪在细胞培养箱内长时程、无干扰、高通量的监测细胞实验全程的生长变化，记录细胞增殖、迁移、凋亡等生命活动的变化过程，实现动态研究调控物质对细胞的影响；CELLImage还支持红、绿、蓝三通道荧光成像，可实现细胞转染效率等荧光成像实验的动态监测，记录细胞荧光的动态变化；CELLImage通过设置实验程序，自动观测细胞并拍照记录，具有生长曲线、荧光强度、Z轴叠加、大图拼接等多种图像数据自动分析功能，实验全程减少人力提高效率，适用一切细胞实验的动态监测和分析。