实验时间：2025年02月26日 14：10-15：26。

实验设备及厂家：CELLImage Mini全自动活细胞成像仪（联庆瑞奇）、离心机（卢湘仪 ）、恒温水浴锅。

实验耗材及厂家：六孔板（中在）、冻存管（中在）。

实验试剂：DMEM培养基（森贝伽）、胎牛血清（森贝伽）、青链霉素溶液（Biochannel）、胰蛋白酶（森贝伽）、DMSO（阿拉丁）。

细胞类型：A375细胞、 ZR751细胞、 HBE细胞。

实验方法步骤：

（1）实验准备：实验开始前，将完全培养液和胰蛋白酶从 4°C 中取出放置到水浴箱预热 30 min 左右。同时，对生物安全柜进行紫外照射消毒杀菌30min；

（2）观察细胞：与此同时，将CELLImage Mini全自动活细胞成像仪运行的程序停止，并观察此时细胞的状态及密度，细胞融合度达到 70%-90%、细胞状态良好即可进行冻存；

A375细胞

ZR751细胞

HBE细胞

（3）洗涤细胞：在生物安全柜内，将六孔板里的原有培养液全部移除，用 1×PBS洗涤细胞两次，去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；

（4）消化细胞：每孔加入200ul胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，37℃孵育 1-2 分钟。在CELLImage Mini全自动活细胞成像仪观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；

消化后A375细胞

消化后ZR751细胞

消化后HBE细胞

（5）终止消化：加入2ml完全培养液终止消化，吹打六孔板底 2-3 次使所有细胞彻底脱壁。将细胞悬浮液到 15 mL 离心管中，分别做好标记；

（6）细胞离心：在室温条件下，将细胞于1000rpm离心5min；

（7）细胞重悬：离心后，在生物安全柜内小心倒去上清，吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液；

（8）细胞计数：取少量单细胞悬液进行台盼蓝染色，吸取染色后的液体加入计数板，用CELLImage Mini全自动活细胞成像仪拍照，随后在Readcells分析端对其计数分析；

（9）二次离心：细胞放置于离心机1000rpm离心5min；

（10）冻存液重悬：离心后，在生物安全柜内小心倒去上清，吸取2 mL冻存液重悬细胞至单细胞悬液；

（11）冻存细胞：将细胞悬液吹打混匀后，均匀加入冻存管中，在对应冻存管壁标记好细胞名称，冻存日期，细胞代数等信息；

（12）程序降温：将细胞放入程序降温盒，放置于-80℃冰箱程序降温，次日转移冻存细胞至液氮储存。

实验总结：

CELLImage Mini全自动活细胞成像仪不仅能够动态监测细胞实验全程的生长变化信息，揭示细胞杀伤、分裂、迁移等生命活动的细微变化过程，记录实验过程中关键信息，实现动态研究调控物质对细胞的影响；而且支持红绿蓝三通道荧光拍摄，对于一些稳转细胞株构建、监测细胞荧光表达、凋亡监测、荧光染料染色实验帮助极大。活细胞动态监测技术实验全程不耗费人力，所有细胞图像的拍摄记录都可以由设备独立完成，实现全自动，高通量，长期稳定性和低干扰的结合。